Manuskript zum Seminarvortrag
von Uwe Schulte

Lehrerfortbildung Karlsruhe, den 27. Februar 1997

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Ionenkanäle und ihre Bedeutung für die Entstehung und Leitung von Aktionspotentialen

A) Grundlagen - Membranpotentiale:

Die Zellmembran ist grundsätzlich für Ionen (geladene Kleinmoleküle und Atome) undurchlässig. Allerdings enthält sie zahlreiche Transmembran-Proteine, die den Austausch von bestimmten Ionen mit der Umgebung ermöglichen. Zur Vereinfachung betrachten wir dieses theoretische Modell:

Sehr schnell stellt sich ein Gleichgewichtszustand ein, in dem das Diffusionspotential und das elektrische Feld entgegengesetzt gleich groß sind (das elektrochemische Potential ist dann 0 und es fließt kein Netto-Strom mehr durch die Membran). Setzt man für beide Größen die physikalischen Formeln ein:

Diffusionspotential:
Elektrische Arbeit:
so erhält man durch Gleichsetzen die Nernst’sche Gleichung:

[Mit DG_K: Chemisches Potential der Kationen, w_el: Arbeit des elektrischen Feldes, R: Allgemeine Gaskonstante, F: Faraday-Konstante, T: Absolute Temperatur, z_K: Ladungszahl des Kations, [K]: Konzentration des Kations,E_m: Elektrische Potentialdifferenz über der Membran]

Zu einer lebenden Zelle bestehen aber einige Unterschiede: Zellmembranen sind für mehrere Ionensorten selektiv permeabel. Die Permeabilität für die einzelnen Ionen ist dabei unterschiedlich und kann gezielt verändert werden. Aktive Transportmechanismen sorgen für die Aufrechterhaltung der Ionenkonzentrationgradienten. Eine Gleichung, die diesen Umständen Rechnung trägt und das Membranpotential von Zellen näherungsweise bestimmt (zweiwertige Ionen werden nicht berücksichtigt), wurde von Goldman 1943 aufgestellt.

Ersatzschaltbild für eine reale Zelle:

Neben dem Membranpotential haben Zellen noch andere Eigenschaften, die für das Verständnis ihres elektrischen Verhaltens wichtig sind:

	Widerstand:	Gemeint ist dabei meistens der ohmsche Widerstand, symbolisiert durch , bezeichnet mit "R"; definitionsgemäß ist die Strom-Spannungsbeziehung linear und R eine Konstante. Für Ionenkanäle wird meist die Leitfähigkeit g angegeben (mit R = 1/Leitfähigkeit).. Membranen besitzen normalerweise einen sehr hohen Widerstand, der mit zunehmender Anzahl von Ionenkanälen abnimmt. Die Mehrzahl der Ionenkanäle befindet sich aber in einem nichtleitenden Zustand. Der Widerstand des Cytoplasmas und der extrazellulären Umgebung ist dagegen relativ gering, da diese wäßrigen Lösungen bewegliche Ionen enthalten, die den elektrischen Strom gut leiten (sog. Elektrolyte).
	Kapazität:	Nach dem obigen Modell muß ein gewisser Strom fließen, damit sich die Membran elektrisch auflädt - sie verhält sich also ähnlich wie ein Kondensator und besitzt eine meßbare Kapazität (symbolisiert durch , bezeichnet mit "C"). Diese wächst mit der Membranoberfläche und hängt von den Membraneigenschaften ab (Dielektrizitätskonstante). Durch die Kapazität werden schnelle Spannungsänderungen und -ausbreitung zeitlich gedämpft .

Diese beiden Größen spielen eine besonders wichtige Rolle bei elektrophysiologischen Messungen und stellen hohe Anforderungen an die Meßtechnik.

Man kann sich Zellen durch einfache Schaltkreise veranschaulichen , die alle beschriebenen Eigenschaften enthalten. Damit kann man das elektrische Verhalten von Zellen simulieren und bestimmte Größen berechnen.

Ersatzschaltbild für eine Zelle (erweitert nach [Hodgkin, A.L. und Huxley, A.F., 1952] )

Die Nernst’schen Ionen-Potentiale sind als Stromquellen, d.h. als elektrochemische Energie in Form von Ionenkonzentrations- gradienten aufzufassen (Symbol:) die Spannung dieser "Batterien" ist das Gleichgewichtspotential der jeweiligen Ionensorte. Die Konzentrations-gradienten von Na⁺ und K⁺ werden im wesentlichen durch die Na⁺ /K⁺-ATPase erzeugt und aufrechterhalten. Dieses Transmembran-Protein arbeitet als elektrogene Pumpe (ATP-getrieben) und liefert daher einen Beitrag von ca. -10 mV zum Ruhepotential: pro hydrolysiertem ATP werden 3 Na⁺ aus der Zelle heraus- und 2 K⁺ in die Zelle hineintransportiert..

Die Ionengradienten - wie auch die Kanäle - sind bezüglich der Membran parallelgeschaltet. Die Spannungen addieren sich mit dem Beitrag der Na⁺/K⁺-ATPase zum Membranpotential. Die Membrankapazität ist parallelgeschaltet, da sie durch den Stromfluß kapazitiv aufgeladen wird.

Für die Größe des Membranpotentials ist das Verhältnis der Permeabilitäten ausschlaggebend:

Ist die Permeabilität eines Ions sehr viel größer als die der anderen, dann nähert sich das Membranpotential dem Gleichgewichtspotential dieses Ions. Da sich die Chlorid-Ionen überwiegend passiv (d.h. E_m folgend) verteilen, ist das Ruhemembranpotential der meisten Zellen durch den K⁺-Konzentrationsgradienten bestimmt.

Nach der gültigen Konvention werden Kationen-Auswärtsströme mit positivem und -Einwärtsströme mit negativem Vorzeichen versehen. Die Erhöhung von E_m wird als Depolarisation, eine Erniedrigung als Hyperpolarisation bezeichnet.

Jede lebende Zelle besitzt ein Ruhe-Membranpotential. Es spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Signaltransduktion, Osmoregulation und bei Transportprozessen durch die Membran. Viele Zelltypen (z.B. Muskelzellen, Neuronen oder Sinneszellen) sind darüberhinaus in der Lage, ihr Membranpotential zu verändern, wodurch wichtige physiologische Reaktionen ausgelöst werden. In den meisten Fällen wird dies durch Permeabilitätsänderungen erreicht, d.h. durch das Öffnen und Schließen von Ionenkanälen. Dieser Weg ist vergleichsweise schnell und energiesparend, das sich die Ionen- konzentrationen dabei kaum verändern. Eine wichtige Ausnahme bildet Ca²⁺: Die intrazelluläre Konzentration dieses Ions ist so niedrig, daß sie sich durch einen Ca²⁺-Einstrom deutlich erhöht und chemische Reaktionen beeinflussen kann.

B) Aktionspotentiale

Die Entstehung von Aktionspotentialen wurde von Goldman, Hodgkin und Huxley in den frühen Fünfziger Jahren aufgeklärt. Sie untersuchten die Veränderungen des Membranpotentials an Riesenaxonen von Tintenfischen. Aufgrund ihrer Größe (Perfusion ist möglich) sind sie bis heute ein beliebtes Untersuchungsobjekt der Neurophysiologen. Strom und Spannung werden mit Glaskapillar-Elektroden gemessen:

Mit einer zweiten Elektrode zur Strom-Injektion ließ sich das Axon de- oder hyperpolarisieren. Die Experimente, die später mit dem Nobelpreis ausgezeichnet wurden, lieferten folgende Ergebnisse:

1. Das Membranpotential verhielt sich gemäß der Goldman-Gleichung. Wenn die Ionen innen wie außen in physiologischen Konzentrationen vorlagen, betrug es ca. -70 mV.
2. Bei stärkerer Depolarisation entstand ein Aktionspotential, d.h. E_m schnellte kurzzeitig ins positive um danach wieder in die Ruhelage zurückzukehren (-70 mV)
3. Aktionspotentiale entstehen nach dem alles-oder-nichts-Prinzip: Nach Überschreiten eines kritischen Schwellenpotentials (ca. -40 mV) wurde immer ein gleichartiges Aktionspotential erzeugt, unabhängig von der Reizstärke.
4. Für eine kurze Zeit nach dem Aktionspotential ist die Membran an dieser Stelle nicht mehr erregbar (Refraktärphase).

Der zeitliche Verlauf eines solchen Aktionspotentials ist in folgendem Diagramm (a) dargestellt:

Welche Ionenströme (b) für die Änderungen der Membran-Spannung verantwortlich sind, kann man mit Hilfe des Ersatzschaltbildes für eine Zelle (siehe oben) ableiten.

Beim Aktionspotential wird eine schnelle Depolarisierung dadurch erreicht, daß die Leitfähigkeit für Na⁺ schnell zunimmt, während gleichzeitig die für K⁺ abnimmt. Diese Änderungen sind auf das Schaltverhalten entsprechender Ionenkanäle zurückzuführen, die im Detail später besprochen werden. Drei Leitfähigkeiten liegen dem Aktionspotential zugrunde:

1. Im Ruhezustand sorgt eine bestimmte Klasse von K⁺-Kanälen für eine hohe K⁺-Leitfähigkeit (V_{m »} -70 mV).
2. Bei einer Depolarisation über eine kritische Schwelle schließen diese Kanäle (g_K sinkt) und gleichzeitig öffnen sich spannungsabhängige Na⁺-Kanäle, die g_Na erhöhen. Dadurch wird die Membran noch stärker depolarisiert, so daß dieser Vorgang sich selbst verstärkt und die Depolarisation in (a) sehr steil verläuft.
3. Die spannungsaktivierten Na⁺-Kanäle inaktivieren nach einer Millisekunde (g_Na sinkt wieder auf den Ausgangswert), während etwas verzögert spannungsabhängige K⁺-Kanäle öffnen und die Membran repolarisieren. Wenn V_m in die Nähe des Ruhepotentials kommt, öffnen sich zusätzlich die K⁺-Kanäle aus 1. wieder, so daß g_K vorübergehend größer wird als im Anfangszustand (das führt zu einer Hyperpolarisation), bis die spannungsaktivierten K⁺-Kanäle aus 2.schließlich wieder inaktivieren (Ruhezustand 1.).

Durch das abgestimmte Verhalten der Ionenkanäle wird ein zeitlich scharfes Spannungssignal mit einem Minimum an Ionenfluß (und damit Energieaufwand) erzeugt. Die Inaktivierung der spannungsabhängigen Kanäle und die Hyperpolarisation sind für die Refraktärphase verantwortlich. Das gesamte Aktionspotential dauert ca. 5 ms.

C) Leitung von Aktionspotentialen:

Die Weiterleitung von Membranpotentialen entlang von Zellmembranen kann grundsätzlich auf zwei Wegen erfolgen:

• Passiv: Durch die Fernwirkung des elektrischen Feldes wird das Potential an benachbarten Membranregionen beeinflußt; Vorteil: Dieser Effekt ist schnell und verbraucht keine Energie; Nachteil: Die Wirkung des elektrischen Feldes nimmt mit dem Quadrat der Entfernung ab (analog der Helligkeit einer Glühbirne), d.h. sie reicht nicht weit. Diese Art der Reizleitung erfolgt in nicht-erregbaren Zellen und in den Dendriten von Neuronen
• Regenerativ: Ein Aktionspotential depolarisiert durch die Feldwirkung (passiv) eine benachbarte, erregbare Membranregion, so daß dort ein neues Aktionspotential erzeugt wird, das sich auf dieselbe Weise kontinuierlich fortpflanzt. Wegen der Refraktärphase erfolgt die Leitung immer nur in eine Richtung. Da das Aktionspotential ständig neu erzeugt wird ist dieser Vorgang langsamer und kostet Energie. Andererseits können so Signale ohne Informationsverlust unendlich weit geleitet werden. Auf diese Weise werden Aktionspotentiale in Neuronen vom Axonhügel (wo sie entstehen) entlang der Axone zu den Synapsen geleitet.
  
  Die Leitungsgeschwindigkeit hängt von der Membrankapazität (C_m), -leitfähigkeit (g_m) und vom Innenwiderstand R_i des Axons ab. Je kleiner Cm, gm und Ri, desto schneller wird die Membran umgeladen (d.h. V_m ändert sich). Normale Axone leiten mit einigen m/s, die Riesenaxone von Tintenfischen (großer Innendurchmesser ® kleinerer R_i) mit bis zu 20 m/s.

Ein Spezialfall ist die saltatorische Erregungsleitung, die die Vorteile von aktiver und passiver Leitung verbindet. Gliazellen (Oligodendrocyten im ZNS und Schwannsche Zellen im PNS) schirmen ca. 1 mm lange Abschnitte der Zellmembran ab, indem sie sich in vielen Lagen um sie herumwickeln. Diese lamellenartige Struktur (Myelinscheide) enthält überwiegend Lipide und charakteristische Myelinproteine zur elektrischen Isolation (niedriges C_m und g_m).

D) Ionenkanäle: Biochemische Grundlagen

Ionenkanäle bestehen aus Proteinen, die sich in der Zellmembran befinden und Poren bilden, durch die Ionen strömen können. Jedes Protein wiederum stellt eine unverzweigte Kette aus vielen Aminosäuren dar, die sich in einer charakteristischen Weise faltet. Die Abfolge der Aminosäuren und die Peptidbindungen werden als Primärstruktur bezeichnet. Lokale Strukturmotive wie Alpha-Helix (s. unten) und Beta-Faltblatt bilden die Sekundärstruktur, und die räumliche Anordnung dieser Elemente stellt die Tertiärstruktur dar. Die meisten Ionenkanäle bestehen aus Protein-Komplexen, d.h. sie werden durch Zusammenlagerung von verschiedenen Protein-Untereinheiten gebildet (Quartärstruktur).

Struktur und chemische Eigenschaften werden durch die Aminosäuren festgelegt. Ungeladene hydrophobe Aminosäurereste befinden sich meist im Inneren des Proteins oder in der Membran (die ja lipophil ist), polare oder saure/basische Aminosäuren bilden im allgemeinen die Protein-Oberfläche, die im Kontakt mit der wäßrigen Umgebung steht.

Ionenkanal-Untereinheiten besitzen in der Regel mehrere Abschnitte, die die Membran durchspannen (Transmembranregionen). Dieses bestehen typischerweise aus Alpha-Helices von etwa 22 hydrophoben Aminosäuren. Die eigentliche Pore wird durch einen Loop aus unterschiedlichen Aminosäuren gebildet; ihre Struktur ist unbekannt.

Biophysikalische Eigenschaften:

• Ionenselektivität (nach Ladung, Größe und Hydrathülle bzw. Ladungsdichte) durch Poren-Selektivitätsfilter
• Einzelkanal-Leitfähigkeit (Ionenpermeation sehr schnell), abhängig von der Ionenstärke; Offenwahrscheinlichkeit
• Schaltverhalten (gating): durch spannungsabhängigen Ionenblock oder Konformationsänderung

Untersuchungsstrategien:

• Untersuchung nativer Zellen (zwei-Elektroden-Voltage-Clamp, Patch-Clamp)
• Heterologe Expression in Xenopus-Oocyten (mRNA-Injektion) oder Zell-Linien (stabile Transfektion oder mRNA-Injektion)

Molekularbiologische Techniken:

• Expressionsklonierung (Einwärtsgleichrichter)
• Proteinsequenzierung, d.h. Proteinaufreinigung, - sequenzierung und degenerierte Primer für PCR auf Library (spannungsabhängiger Natrium-Kanal)
• Mutations-Klonierung, d.h. Lokalisierung eines Defekts auf einem Gen (Shaker-Mutante betrifft spannungsabhängigen Kalium-Kanal)
• Homologie-Klonierung mit Primer aus konserviertem Sequenzabschnitt
• Deletions- und Punktmutanten und Chimären erlauben Identifizierung funktioneller Determinanten
• Strukturaufklärung (NMR, Röntgenbeugung an Kristallen, Hydropathie-Plots)
• Chemische Modifikation (selektiv) von Aminosäure-Seitenketten

E) Klassifizierung von Ionenkanälen:

Die bekannten Ionenkanäle können nach folgenden Kriterien in 3 Klassen eingeteilt werden, von denen heute aber auch Überschneidungen und Ausnahmen bekannt sind:

1. Strukturell, d.h. nach der Untereinheiten-Zusammensetzung und der molekularbiologischen Verwandtschaft
2. Anhand der Ionen-Selektivität, d.h. der Fähigkeit, nur für Ionen bestimmter Ladung oder selektiv für Ionen eines Elementes permeabel zu sein.
3. Nach dem Schaltverhalten, d.h. den Mechanismen, die zum Öffnen und Schließen von Ionenkanälen führen.

I Ionenselektive (Beispiel: Spannungsabhängiger Na⁺-Kanal):

Sie bestehen aus 4 homologen Transmembran-Proteinen (homo- oder heterotetramer) oder einem Tandem-Tetramer und sind in der Regel hochselektiv. Man unterscheidet die spannungsabhängigen (voltage-gated) Na⁺, Ca²⁺ und K⁺ und die einwärtsgleichrichtenden (inwardly rectifying) K⁺-Kanäle:

II Liganden-gesteuerte; Beispiel: Nikotinischer Acetylcholin-Rezeptor):

Unter Rezeptoren versteht man hier Makromoleküle (Proteine), die durch Bindung von bestimmten Molekülen (Liganden) biochemische Reationen auslösen (pharmakologisch-biochemische Definition).

Die Liganden sind im Gegensatz zu den Rezeptoren nicht an signalvermittelnde Strukturen gekoppelt (d.h. in der Regel frei beweglich) und liegen im Überschuß vor. Man unterscheidet Agonisten, d.h. Liganden, die mit hoher Affinität an den Rezeptor binden und eine Reaktionskaskade auslösen, und Antagonisten, d.h. Liganden, die zwar ebenfalls mit hoher Affinität an den Rezeptor binden aber dabei keine Reaktion auslösen (Rezeptor-Blocker).

Die klassischen Vertreter werden aus 5 Untereinheiten gebildet (Hetero-Pentamere) und sind Kationen- oder Anionen-selektiv. Sie funktionieren als Rezeptoren, die durch Bindung von spezifischen Liganden (Neurotransmittern bei chemischen Synapsen beispielsweise) ihre Ionenpore öffnen.

III gap junction-Kanäle

Diese Strukturen bestehen aus zwei transmembranären Connexin-Komplexen (s. unten), die sich immer gegenüberliegen. Sie bilden direkte Kontakte zwischen Zellen mit großen Poren, durch die Stoffe mit einem Molekulargewicht von bis zu 1000 Da gelangen können. Nur in Ausnahmefällen, z.B. bei einem starken Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration (kann durch den Tod der Nachbarzelle hervorgerufen werden) schließen diese Poren.

F) Spannungsgesteuerte Ionenkanäle

Nach ihrer Selektivität bilden sie die Familien der K_V, Na_V und Ca_V-Kanäle, die alle homolog gebaut sind.

Spannungsabhängige Natrium-Kanäle wurden als erste Vertreter dieser Klasse aus dem elektrischen Organ des Zitteraals (Torpedo) isoliert. Das ermöglichte die Sequenzierung des Gens und eine eingehende molekularbiologische Untersuchung der Kanal-Eigenschaften und der Struktur. Der Kanal besteht aus einem großen Protein, das ein Tandem von 4 Domänen aus je 6 Transmembranhelices darstellt. Die Pore mit dem Selektivitätsfilter wird aus den vier P-Schleifen gebildet. NaV wird durch Depolarisation schnell aktiviert und inaktiviert von selbst innerhalb von Millisekunden (vergleiche seine Bedeutung bei der Bildung von Aktionspotentialen).
Spannungsabhängige Ca2+-Kanäle vermitteln meist biochemische Reaktionen auf einen elektrischen Reiz hin, da Ca2+ einen wichtigen intrazellulären Botenstoff darstellt. Wichtige Beispiele sind die Muskelkontraktion, die exocytotische Freisetzung aus Vesikeln (z.B. bei der Neurosekretion oder an der Synapse) oder die Differenzierung von bestimmten Zelltypen auf einen depolarisierenden Reiz hin. Die Struktur ist der von NaV-Kanälen sehr ähnlich. Die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetik ist dagegen langsamer.
KV-Kanäle bestehen aus Tetrameren von 4 getrennten Protein-Untereinheiten, die den Domänen der obigen Kanäle vollständig homolog sind. Diese Familie zeichnet sich jedoch durch eine große funktionelle Vielfalt von spezialisierten Subtypen aus, die sich vor allem in ihrem gating-Verhalten unterscheiden. Am bekanntesten sind die ‘delayed rectifier’ Kanäle, die für die Repolarisation beim Aktionspotential verantwortlich sind. Sie werden mit einer gewissen Verzögerung durch Depolarisation aktiviert und inaktivieren etwas langsamer als NaV-Kanäle.

Der Spannungs-Sensor ist bei allen drei Familien gleich aufgebaut und funktioniert nach folgendem Prinzip:

Die Membranspannung erzeugt ein elektrisches Feld über der Membran, das auf die darin befindlichen Ladungen eine anziehende oder abstoßende Kraft ausübt (vergleiche das Kapitel Membranpotential). Proteine besitzen aber aus energetischen Gründen (Löslichkeit) in der Regel keine geladenen Aminosäurereste in ihren Transmembranhelices (die sich ja in einer hydrophoben Umgebung befinden). Eine Ausnahme bilden die S4-Helices bei den spannungsgesteuerten Kanälen, die einige positiv geladene Aminosäuren (Arginin) enthalten. Die Änderung des elektrischen Feldes (d.h. des Membranpotentials) führt zu einer schraubigen Bewegung dieses Proteinabschnitts und dadurch zum Öffnen und Schließen der Pore.

Die endogene schnelle Inaktivierung der offenen Kanäle erfolgt durch eine N-terminale Domäne. Diese ist wie ein angeketteter Ball gefaltet und verschließt die Pore spannungs-abhängig von innen

D) Einwärtsgleichrichtenden Kanäle (K_ir)

Die einwärtsgleichrichtenden bilden tetramer gebaute, K⁺-selektive Kanäle. Eine Untereinheit besitzt nur zwei Transmembranhelices (homolog zu S5 und S6) und eine P-Region:

Beispiel: Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Messung von IRK (einem starken Einwärts-gleichrichter) bei verschiedenen Ionenkonzentrationen an Xenopus-Oocyten:

Zu erkennen sind die Verschiebung des Gleichgewichtspotentials (Umkehrpotentials) und die Änderung der Einzelkanal-Leitfähigkeit (Kurvensteigung) mit der extrazellulären Kalium-Konzentration.

Aus der Strom-Spannungsbeziehung wird deutlich, woher diese Kanäle ihren Namen haben. Bei Spannungen negativ vom Umkehrpotential (das sich nach Nernst mit der extrazellulären K⁺-Konzentration verschiebt) sind die Kanäle leitend, d.h. sie verhalten sich wie ohmsche Wider-stände. Bei Spannungen positiv von E_K nimmt die Auswärtsstrom-Leitfähigkeit bis auf 0 ab. Der zugrundeliegende Mechanismus ist ein Block durch mehrwertige intrazelluläre Kationen (vor allem Spermin und Mg²⁺), der von der treibenden Kraft (aus Membranspannung und Kalium-Konzentrationsgradient) für den Ionenstrom abhängt:

V_r = V_m - E_K

Diese Eigenschaft ist wichtig bei der Erzeugung von Aktionspotentialen. Da diese Kanäle für die hohe K⁺-Leitfähigkeit beim Ruhe-Membranpotential verantwortlich sind, kann über ihre Regulation die Erregbarkeit der Zelle gesteuert werden. Außerdem haben diese Kanäle noch spezielle Aufgaben ( z.B. K_ATP bei der Insulin-Sekretion, Kalium-Ausscheidung in der Niere).

Abbildungen:

Ein Teil der Abbildungen stammt (z.T. verändert und in reduzierter Qualität) aus den nachstehend aufgeführten Quellen.

Literatur:

• Voet, D. und Voet J.G (1992): Biochemie; VCH-Verlag 1992
• Fakler, B. und Ruppersberg, J.P. (1996): Functional and molecular diversity classifies the family of inward-rectifier K⁺ channels; Cell. Physiol. Biochem. - im Druck
• Kandel, E.R., Schwartz, J.H. und Jessell, T.M. (1991): Principles of neural science; 3rd Edition, Appleton&Lange USA (1991)
• Hodgkin, A.L., Huxley, A.F. (1952): A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve; J. Physiol. 117: 500-544