Über Plasmabrücken können Bakterien Gene austauschen. Der Spender Escherichia coli K12 L17 hat die Fähigkeit, Laktose zu Milchsäure abzubauen. Auf MacConkey-Agar bildet er rote Kolonien. Gegenüber dem Antibiotikum Streptomycin ist er jedoch empfindlich. Daher kann er auf streptomycinhaltigem MacConkey-Agar nicht wachsen. Der Empfänger Escherichia coli K12 CSH 36 ist gegenüber Streptomycin resistent; kann jedoch Laktose nicht abbauen. Er bildet weiße Kolonien.
Der
gebildete Transkonjugant ist nun streptomycin-unempfindlich und kann Laktose
abbauen. Dieser wächst also auf streptomycinhaltigem Agar und zeigt den
Laktoseabbau zu Milchsäure durch Rotfärbung des Indikators in den Kolonien.
Material (für 10 Gruppen)
Übernachtkulturen des Spenders Escherichia coli K12 CSH36, DSM 6253) und des Empfängers (Escherichia coli K12 L17, DSM 6254)
Standard-Nährbouillon (enthält 5,0 g Pepton, 3,0 g Fleischextrakt, 15 g NaCl auf 1000 ml Aqua dest., fertig z.B. von Fluka 70123)
MacConkey-Agar mit Streptomycinzusatz (10 g MacConkey-Agar (Merck 105465) auf 200 ml Aqua dest.). Kurz vor dem Abkühlen auf ca. 50 0C wird dem Agar eine Lösung von 40 mg Streptomycinsulfat (Sigma 6501) in 2 ml sterilem Aqua dest. zugegeben)
Sterile Petrischalen (d =90 mm, für ca. 15 -20 ml Agar)
Impföse oder sterile Wattestäbchen
20 sterile Reagenzgläser mit Alu Abdeckung oder Steristopfen (für Übernachtkulturen)
30 sterile Pipetten (10 ml, 2 ml, 2 m1) mit Pipettierhilfen
10 sterile Erlenmeyerkolben (50 ml) mit Alu-Abdeckung oder Steristopfen
Brutschrank
Wasserfester Filzschreiber
1.
Tag
Herstellen von 200 ml sterilen Nährbouillon. Pro Gruppe werden 2x 5 ml Nährbouillon in Reagenzgläsern (für Übernachtkulturen Spender und Empfänger) und 9 ml Nährbouillon in 50 ml Erlenmeyerkolben autoklaviert.
Ansetzen
je 5 ml der Übernachtkulturen von Spender- und Empfängerbakterien nach
beiliegender DSM-Anweisung. Diese werden bei 370C über Nacht bebrütet.
Petrischalen (eine pro Gruppe) werden mit streptomycinhaltigem MacConkey-Agar gefüllt. Dazu muss 2 ml H2O zum Ansetzen von Streptomycinsulfatlösung autoklaviert werden. (Vorsicht: Streptomycinsulfat darf nicht autoklaviert werden!
2. Tag (Arbeitsaufwand: ca. 15 min, nach mindestens 3 h Wartezeit: 15 min)
4.
Herstellung des Transkonjuganten: In den 50 ml Erlenmeyerkolben werden
nacheinander
pipettiert:
9 ml Nährbouillon, 0,2 ml Übernachtkultur Empfänger und 0,8 ml Übernachtkultur
Spender. Dann wird mindestens 3 Stunden bei 37 0C
bebrütet.
5. Die Petrischale wird auf der Unterseite gleichmäßig in drei Sektoren unterteilt und die Sektoren markiert (Spender, Empfänger, Transkonjugant, siehe Abbildung)
6. Jeder Sektor wird mittels Impföse oder Wattestäbchen mit dem jeweiligen Bakterienstamm beimpft. (Impföse nach jedem Beimpfen ausglühen und abkühlen lassen)
7. Bebrüten bei 37 0C (eine Nacht)
3.Tag
(ca. 15
min)
8.
Auswertung
Tip:
Frische Spender-Stämme verwenden; ältere verlieren gern ihr Plasmid.
Beimpfte Agarplatten nicht länger als eine Nacht bebrüten oder vor dem Bebrüten maximal eine Woche im Kühlschrank aufbewahren, da die Empfängerstämme sich mit der Zeit auch rot färben können.
H.
Bayrhuber und E. Lucius: Handbuch der praktischen Mikrobiologie und
Biotechnik
Bd.2 Schroedel Verlag 1997
M. Müller: Zwei Versuche mit natürlichem Gentransfer: PdN-Ch. 4/47. Jg. 1998, 19 - 20