Versuch 1b (mit dem Kit 01):

Nachweis von Restriktions- und Modifikationsenzymen in E.coli

von Dr. Rolf Lutz

 

Übersicht

  1. Grundlagen

  2. Material

  3. Durchführung

Grundlagen:

Der Versuch reproduziert (in leichter Abwandlung) das klassische Experiment, aus dem Arber, Nathans und Smith 1968 die Existenz der heute wohlbekannten Restriktionsenzyme und der zugehörigen Methyltransferasen postuliert und später auch nachgewiesen haben.

Ausgangspunkt für das Experiment sind die E. coIi-Stämme DH5a bzw. DH5apRM. Letzterer enthält zusätzlich auf einem Plasmid (p) die Gene, die für ein Restriktionsenzym (R) sowie die dazugehörige Methyltransferase (M) kodieren. Die Plasmidkarte von pRM ist in Abb. 1 dargestellt.

Beide Stämme werden mit Lambda-Phagen infiziert, die aus dem Stamm DH5a stammen, deren DNA also nicht methyliert ist. Um die Herkunft der Phagen deutlich zu machen, werden diese als l.a bezeichnet.

Das Infektionsvermögen (,,Plattierungseffizienz") der Phagen auf den beiden Stämmen wird anhand der Anzahl der gebildeten Plaques auf den Bakterienrasen bestimmt und als ,,Plattierungseffizienz" (engl. ,,efficiency of plating", EOP) bezeichnet. Diese ist bei Stamm E. coli DH5apRM ca. 104 fach geringer als bei E. coIi DH5a.  Hieraus kann man schließen, dass E. coli DH5apRM ein Schutzsystem besitzen muss, das den Stamm effizient vor einer Infektion durch l.a schützt.

 



















                     Funktionskarte des Plasmids pRM
Diejenigen Phagen, denen es gelingt das Schutzsystem von E. coli DH5apRM zu umgehen, können dann wiederum ihren Wirtstamm  mit der gleichen Effizienz infizieren wie den Stamm E. coli DH5a, dem der Schutzmechanismus fehlt. Dies liegt daran, dass die DNA der aus E. coli K freigesetzten Phagen (l.apRM) durch das Enzym Methyltransferase an den Erkennungsstellen des Restriktionsenzyme methyliert wurde und somit von E. coli D}{5czpRM nicht mehr als fremd erkannt werden kann. Die eigentliche Funktion der Methyltransferase ist es, durch Methylierung der bakteriellen DNA diese vor dem Abbau durch die eigenen Restriktionsendonukleasen zu schützen. Infiziert und lysiert der Phage l.apRM erneut den Stamm E. coIi DH5a (der kein Restriktions- und Methylierungssystem besitzt), wird die neu synthetisierte  Phagen-DNA nicht methyliert und kann von E. coli DH5apRM wiederum als fremd erkannt werden. Damit schließt sich der in Abb. 2 dargestellte Zyklus.


















Restriktion uns wirtszellkontrollierte Modifikation des Phagen Lambda

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Material:

Versuchs-Kit 01, (-> Bestellung)

Puffer-Lösungen (Rezepte)

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Durchführung der Experimente

Experiment 1 

Das Experiment dient dem Nachweis, dass ein Bakterium mit Restriktions­Modifikationssystem gegen das Eindringen von Lambda-Phagen, deren Genom aus nicht­methylierter DNA besteht, geschützt ist.

Vorarbeiten am Vortag :

 1.1.1       Entnehmen Sie von den LB-Platten je eine Einzelkolonie der beiden E. coli -Stämme und impfen Sie diese in 5 ml LB Medium (DH5apZE1 und DH5apRM mit 100 mg/ml Ampicillin) mit l0mM MgSO4 / O,2% Maltose an. Die Kulturen sollten auf einem Roller oder Schüttler über Nacht bei 300C - 370C aufgezogen werden.

Vorarbeiten am Experimentiertag:

1.2.1       Aufkochen von LB-Agar (Vorsicht vor Siedeverzug!) und Gießen von 4 LB Agarplatten ohne Antibiotika (pro Platte werden ca. 15-20 ml LB-Agar benötigt). Beschriften Sie die Agarplatten auf dem Boden wie folgt:

1.: DH5a + 103l.a                            2.: DH5a + 105 l.a         

3.: DH5apRM + 103l.a                     4.: DH5apRM + 105l.a

1.2.2       Aufkochen von LB-Top Agar und portionieren zu je 4 ml in die mitgelieferten Reagenzröhrchen und temperieren auf 43°C in einem Wasserbad.

Experiment:

1.3.1       Je 1 ml der Über-Nacht-Kulturen von DH5a und DH5apRM  werden in einer Tischzentrifuge sedimentiert (5.OOOUpm, 3min), der Überstand verworfen, und die Bakterienpellets in je 0,5 ml 10mM MgSO4-Lösung durch Schütteln vollständig (!) resuspendiert. Die Stämme können so bis zu 3 Tage bei 40C gelagert werden.

1.3.2       Verdünnen Sie in einem Eppendorfgefäß 10 ml des im Kit enthaltenen Lysats von  l.a             mit 330 ml einer l0mM MgSO4 Lösung. Daraus resultiert ein Titer von 106 pfu/ml. 10 mI dieses Lysats wiederum werden zu 990  mI 10 mM MgSO4-Lösung gegeben (resultierender Titer: 104 pfu/ml).

1.3.3       Geben Sie aus den beiden Verdünnungen je l00 ml Phagenlysat zu l00 ml der resuspendierten Bakterien. Die Anzahl der pfu pro LB-Agarplatte beträgt dann 105 bzw. 103.

1.3.4       Zur Adhäsion der Phagen an die Wirtszellen werden die Ansätze für 20 min bei 370C inkubiert.

1.3.5       Nach dieser Inkubationszeit werden die Ansätze mit je 4 ml vorgewärmtem LB-Top Agar durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt (wenn möglich, luftblasenfrei), sofort auf die entsprechenden LB-Agarplatten gegossen und durch leichtes Schwenken so verteilt, daß eine geschlossene Top-Agar-Schicht entsteht.

1.3.6    Nach Erstarren der Platten (Dauer ca. 1 min) werden diese mit dem Deckel nach unten bei 300 - 370C über Nacht (rnindestens jedoch für 8 Stunden) inkubiert.

1.3.7    Die sichtbar gewordenen Plaques werden ausgezählt.

 

Auswertung zu Experiment 1:

Zählen Sie (sofern möglich) die entstanden Plaques auf den Bakterienrasen aus. Auf der Platte “DH5apRM + 105l.a” sollten etwa 5-20 Plaques sichtbar werden. Die Platte ,, DH5apRM + 103l.a" sollte einen Bakterienrasen ohne Plaques enthalten. Auf der Platte DH5a + 103l.a sollten ca. 1000 voneinander abgegrenzte Plaques sichtbar werden. Auf der Platte DH5a + 105 l.a sollten so viele Plaques entstanden sein, dass kein Bakterienrasen mehr sichtbar sein sollte. Man spricht hier von ,,konfluenter Lyse”.

Experiment 2:   Vervollständigung des Infektionszyklus::

Diejenigen Phagen l.a, die nicht durch das Restriktionssystem des Stammes DH5apRM an der Infektion gehindert wurden und folglich Plaques auf einem Bakterienrasen dieses Stammes gebildet haben, sollten nun ihrerseits über methylierte DNA verfügen und somit die beiden Stämme DH5a und DH5apRM mit der (annähernd) gleichen Effizienz infizieren können. Dies kann in einem Folgeexperiment getestet werden. Hierzu müssen zunächst die betreffenden Phagen isoliert und deren Titer bestimmt werden. Dies geschieht auf folgende Weise:

2.2.1    Stanzen Sie mit dem rückwärtigen Ende einer Pasteurpipette oder einer abgeschnittenen Spitze einer Mikroliterpipette einen Plaque auf der Platte mit der Beschriftung DH5apRM + 105l.a aus und überführen Sie deren Inhalt in ein Eppendorfgefäß.

2.2.2    Geben Sie 1ml SM-Puffer und 50 ml Chloroform zu und schütteln Sie kurz. Das Chloroform dient dazu, die mitüberführten Bakterien abzutöten. Die Phagen sind dagegen resistent gegenüber Chloroform. Lassen Sie die Lösung für mindestens 15 min bei Raumtemperatur stehen, damit sich die Phagen aus dem Agar lösen und sich das Chloroform absetzt. Die Phagen können so für mehrere Jahre im Kühlschrank (<100C) gelagert werden.

2.2.3           Beschriften Sie vier LB-Agarplatten folgendermaßen:

                   1.: DH5a + 10-3 l.apRM                                2.: DH5a + 10-5 l.apRM

                   3.: DH5apRM + 10-3 l.apRM                       4.: DH5apRM + 10-5 l.apRM

2.2.4          Verdünnen Sie die Phagen (aus 2.2.2) 1:103 und 1:105 in l0 mM MgSO4. Geben Sie hierzu 5ml  aus dem Lysat lapRM zu 5 ml MgSO4-Lösung und hieraus wiederum 10mI zu 990ml MgSO4-Lösung.

2.2.5           Mischen Sie je l00ml aus den beiden Verdünnungen mit je l00 ml des Stammes DH5a und DH5apRM (hierzu können die bereits in 10 mM MgSO4 resuspendierten Bakterien verwendet werden, sofern diese nicht älter als 3 Tage sind).

2.2.6           Zur Adhäsion der Phagen an die Wirtszellen werden die Ansätze für 20 min bei 370C inkubiert.

2.2.7           Nach dieser Inkubationszeit werden die Ansätze mit je 4 ml vorgewärmtem LB-Top Agar durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt (möglichst luftblasenfrei), sofort auf die entsprechenden LB-Agarplatten gegossen und durch leichtes Schwenken so verteilt, dass eine geschlossene Top-Agar-Schicht entsteht.

2.2.8           Nach Erstarren der Platten (Dauer ca. 1 min) werden diese mit dem Deckel nach unten bei 30-370C über Nacht (mindestens jedoch für 8 Stunden) inkubiert.

2.2.9           Die sichtbar gewordenen Plaques werden ausgezählt.

 

Sollten sich keine Plaques auf der betreffenden LB-Agarplatte gebildet haben, so können Sie das Experiment alternativ mit dem mitgelieferten Phagenlysat von l.apRM durchführen.

2.2.4           Geben Sie 50 ml aus dem Lysat l.apRM (5x104 pfu/ml) zu 250 ml einer l0mM MgSO4-Lösung (resultierender Titer: 104 pfu/ml).

2.2.5           Mischen Sie je 100 ml aus dem Lysat mit je 100 ml des Stammes DHSa und DH5apRM (hierzu können die bereits am Vortag in l0mM MgSO4 resuspendierten Bakterien verwendet werden, sofern diese nicht älter als 3 Tage sind).

2.2.6           Die weitere Vorgehensweise ist die gleiche wie unter 2.2.6 beschrieben.

Auswertung zu Experiment 2:

Auf beiden LB-Agarplatten sollte in etwa die gleiche Anzahl an Plaques sichtbar werden. Auf der Platte DH5apRM + 103  l.apRM werden etwas weniger Plaques erscheinen, da das Restriktionssystem dem Stamm noch einen Restschutz verleiht.

 

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