Versuch 1a:   Plaque-Bildung durch Bakteriophagen

 

Übersicht

  1. Grundlagen

  2. Material

  3. Durchführung

  4. Tip

  5. Literatur

Grundlagen:

Wenn der lnfektionszyklus eines Bakteriophagen im Wirtsbakterium schnell und vollständig abläuft1 handelt es sich um einen lyrischen Zyklus. Durch Auflösen (Lyse) der Bakterien werden die in ihnen massenhaft vermehrten Phagen freigesetzt. Wird die Bakteriensuspension unmittelbar nach dem Zusetzen von Phagen auf Agar ausplattiert, ist die Lyse der Bakterien in Form von Plaques auf dem Bakterienrasen sichtbar Jeder Plaque ist eine klare Zone. Sie entsteht, weil infizierte Bakterien sich auflösen und die dabei freigesetzten Phagen benachbarte Bakterien infizieren, die dann wiederum lysieren. 

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Material:

Alufolie, z.T. sterile Pipetten, Brenner, Schnellkochtopf oder Autoklav, Drigalskispatel, Eppendorfgefäße & Ständer, lx 100-ml- u. 2x 750-ml-Erlenmeyerkolben, Reagenzgläser, Impföse, Petrischalen (Æ = 90 mm), Brutschrank, Waage, 37 0C-Wasserbad, Filzstift, demineralisiertes Wasser, Nähragar (Fluka 70148), Nährbouillon (Fluka 70123), Desinfektionsmittel.

E.coli (DSM 613), Phage T4-Aktivkultur (DSM 4505).

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Durchführung

1. Tag 

Übernachtkultur (ÜK) von E.coli ansetzen und Agarplatten gießen:

Vorbereiten (für 10 Gruppen):

(1) 50 ml Nährbouillon nach den Angaben des Herstellers zubereiten.
(2)   1 l    Nähragar nach den Angaben des Herstellers zubereiten.

Sterilisieren:

(1)und (2) im Schnellkochtopf (1150C, 30 min) oder im Autoklav (1210C, 20 min) sterilisieren.

Weitere Arbeiten:

(3) Mit sterilisiertem Nähragar pro Gruppe 4-5 Agarplatten gießen.
(4) DSM-Röhrchen öffnen (siehe [1] Bayrhuber/Lucius Bd.3, 20/21) und das darin befindliche E.coli-Pellet in den Erlenmeyerkolben (1) mit abgekühlter, steriler Nährbouillon überführen.

Pellet ca. 20 min lang quellen lassen. Danach den Inhalt dieses Erlenmeyerkolbens gut mischen und im Brutschrank bei 30-37 0C, 12-14 h lang inkubieren (bebrüten) => ÜK.

2. Tag   Infektion von E.coli mit Bakteriophagen und Anlegen der Plattenkulturen:

(5)    Infektionsansätze herstellen:

Eppendorfgefäß Nr.

 E. coli Übernachtkultur T4-Lysat
1

0,5ml oder weniger

- (Kontrolle)
2

0,5 ml

1 Impfösen-Portion
3

0,5 ml

1 Tropfen
4

0,5 ml

2 Tropfen

 

 (6)    Zur Adhäsion der Phagen an die Wirtszellen werden die Ansätze 1-4 für 20 min bei 37 °C inkubiert (Wasserbad oder Trockenschrank).

 (7)      Herstellen von 100 ml Top-Agar: 100 ml Nährbouillon und 100 ml Nähragar nach Angaben des Herstellers ansetzen und mischen. Das Gemisch erhitzen bis sich der Agar vollständig gelöst hat. Je 4 ml des Top-Agars in Reagenzgläser füllen, diese anschließend sterilisieren und im Wasserbad bei 45 °C temperieren.

 (8)    Die 4 Infektionsansätze werden nacheinander mit je 4 ml Top-Agar gemischt und sofort auf eine Agarplatte gegossen. Die Platten werden mit dem Deckel nach unten bei 37 °C für 24 h inkubiert.

3.Tag (ca. 15 min)  

                (9)    Die nun sichtbaren Plaques werden ausgezählt.

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 Tip:

Für Unterrichtszwecke kann das T4-Lysat mit sterilem Aqua dest. bis zum Volumenverhältnis 1:10 verdünnt werden.

 

Literatur:

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