Versuch:   Gram-Färbung

Übersicht Grundlagen Hitzefixierung Material Durchführung Färbung Material Durchführung Literatur
	Gram-Färbung einer Mischkultur von  E.coli (hellrot-rosa, gram-negativ) und  Bacillus megatherium (dunkelblau-violettschwarz, gram-positiv).

Grundlagen:

Die von dem Arzt Christian Gram 1884 entwickelte Färbemethode hat eine wichtige Bedeutung in der Bakteriensystematik. Gram-positive Bakterien haben ein besonders dickes Mureinnetz in der Zellwand, was die Farblackabgabe beim Entfärben verhindert. Gram-positive Bakterien erscheinen violett-schwarz; gram-negative hellrot.

Der eigentlichen Gramfärbung geht eine Hitzefixierung voraus. 

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Hitzefixierung

Material (pro Gruppe):  

• Übernachtkulturen oder Agarkulturen von Bakterien,
  z.B. B.megaterium (+) und E.coli (-)

• Brenner

• 2 Objektträger mit Deckglas

• 2 Tropfpipetten oder 2 Glasstäbe

• Spiritus

• Papiertücher

Durchführung:  

Entfetten der Objektträger (z.B. mit Spiritus) Aufbringen der Bakteriensuspension (1 kleiner Tropfen) auf einen Objektträger mit einem Glasstab. Alternativ: Aufbringen von wenig Zellmaterial aus einer Agarkultur, das mit einem Glasstab in einem Tropfen Leitungswasser suspendiert wird.
Gleichmäßiges Verteilen der Suspension mit einem Deckglas oder Objektträger (Ausstrich) Ausstrich an Luft trocknen lassen! Fixieren:  Bakterien mit Schichtseite nach unten dreimal kurz durch die kleine Brennerflamme ziehen. Nach erfolgter Hitzefixierung wird die Gramfärbung durchgeführt.

Färbung

Material (pro Gruppe):  

• Hitzefixierte Bakterien

• Färbewanne oder Papiertücher

• Spiritus

• LUGOLsche Lösung

• Grams Carbol-Gentianaviolettlösung (Kristallviolettlösung)

• Gram's Safraninlösung

• Immersionsöl

• Mikroskop

• Tropfpipetten

Durchführung:  

• Färben
  Auftragen von 1-2 Tropfen Kristallviolettlösung, 
  3 Minuten einwirken lassen.
  

• Beizen
  Farblösung nicht abspülen, sondern abgießen
  Zwei- bis dreimal mit LUGOLscher Lösung nachspülen (Tropfpipette)
  Dann LUGOLsche Lösung 2 Minuten einwirken lassen
  Abgießen; nicht mit Wasser spülen
  

• Entfärben
  Auf schräg gehaltenem Objektträger mit Spiritus spülen (Tropfpipette), bis keine Farbwolken mehr sichtbar sind (nur wenige Sekunden).
  Unterseite des Objektträgers mit Papiertuch reinigen.
  

• Gegenfärbung
  2 - 3 Tropfen Safraninlösung auftragen. 
  Nach 5 Minuten die Safraninlösung abgießen. 
  Erst mit Leitungswasser; dann mit Aqua dest. spülen.
  Präparat an der Luft trocknen lassen!
  

• Mikroskopieren
  Ölimmersion ohne Deckglas!

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Literatur:

• H. Bayrhuber und E. Lucius:  Handbuch der praktischen Mikrobiologie und Biotechnik
  Bd.1 Schroedel Verlag 1997

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